作者：李根林 王 钢 王津津 陆文秀 王景昭

【摘要】 目的 探讨PTK切削方式下，准分子激光切削视网膜制备理想感光细胞片层所需的最佳切削深度。方法 以新生小牛视网膜为研究对象，白明胶作载体，液态视网膜铺片法铺片，准分子激光PTK切削方式，共切削3种深度，制备48个感光细胞片层，行光镜和电镜观察。结果 用准分子激光PTK切削方式，80μm切削深度下可以获得较好的视网膜感光细胞片层，光镜和扫描电镜均显示完整的感光细胞节段、外颗粒层、外网状层以及部分残存的内颗粒层细胞，而50μm和100μm深度则分别较浅和较深。结论 80μm是准分子激光PTK方式切削视网膜制备感光细胞片层的适宜切削深度。

【关键词】 视网膜 准分子激光 PTK方式 感光细胞片层 80μm切削深度
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【Abstract】 Objective To study the ideal ablation depth for harvesting sheets of photoreceptor cells from retina by using the excimer laser with PTK (phototherapeutic keratectomy，PTK) mode.Methods Retinas from neonatal calf，and gelatin as carrier were used.The retinas were located firstly and then laid on the surface of gelatin carrier using the devised liquid-phase method.The PTK mode of excimer laser was used to ablate retinal sheet.Total 48 photoreceptor sheets were ablated with three depths and were studied by light and scanning electron microscope.Results With 80 micron depth of ablation，photoreceptor cells were harvested as intact sheets from the retinas using the excimer laser.Light and scanning electron microscope demonstrated the sheets of photoreceptor cells with intact outer and inner segments，outer nuclear layer，outer plexform layer and some remained inner nuclear layers.However，50μm and 100μm were found to be either rather superficial or deeper than that of 80μm.Conclusion For harvesting ideal intact photoreceptor cell sheets，80 micron would be the most suitable depth of ablation by using the PTK mode of excimer laser.

【Key words】 retina excimer laser PTK mode photoreceptor sheets 80 micron ablation

制备理想的感光细胞片层是获得视网膜移植良好手术效果的前提之一。目前制备感光细胞片层的方法有多种，包括准分子激光切削法［1，2］、振荡切削机切片法［3］等。其中准分子激光切削法因其操作简单，易于重复等特点成为目前视网膜移植研究中最常用的感光细胞片层制备手段。但在不同切削方式下，准分子激光切削视网膜制备理想感光细胞片层的要求不同，所选定的切削深度也就不同。本研究旨在探讨在PTK(phototherapeutic keratectomy)切削方式下准分子激光切削视网膜制备完整感光细胞片层所确定的最佳切削深度，以指导视网膜移植研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 眼球来源 实验选用出生时即处死的新生小牛，均源于北京市红星屠宰场。所取眼球于冷生理盐水中，4℃下保存，4h内完成眼球处理。本实验共用眼球6个。

1.1.2 20%白明胶载体制备 量取50ml林格液于三角烧瓶中，加热到80℃时，将称量好的白明胶10g倒入。搅拌使明胶充分溶解，避免出现不溶解的白明胶块。将其移至42℃水浴中保存备用，静置20min。然后将白明胶液移置一培养皿中，在22℃下保存。待制作超薄载体用。

1.1.3 超薄白明胶载体制备 取已配制好的20%白明胶，用特制载玻片一张，根据公式S·H=V［S：铺片的表面积(mm2)，H：欲制载体厚度(mm)，V：白明胶使用量(ml)］，制备厚度为40μm的超薄白明胶载体数张，-20℃下凝固后，制备成5mm×5mm×0.4mm大小的载体待用。

1.2 方法

1.2.1 视网膜预定位和液相铺片法［4］：（1）分离眼杯：将所取眼球置于一自制的眼球切割平台上，从眼球角膜缘后2mm处环形切开眼球，先分离开前、后眼杯。将带有玻璃体的后眼杯转移到一普通培养皿中，用镊子轻轻将玻璃体与视网膜分离开后，露出视网膜，使眼杯口朝上，将眼杯内加入少量液体。（2）视网膜定位和取材：用一特制视网膜定位器从视神经乳头始放射状向周边行视网膜定位，然后用直径为6mm的视网膜环钻器依次在每个视网膜上取8个圆形视网膜。用自制的视网膜转移托并配合虹膜恢复器将取好的视网膜转移到一预置的培养皿内。（3）液相视网膜铺片：取直径为20cm，深度为15cm，内含MEM的培养皿，收集已预定位取材的视网膜切片。取上述带有超薄白明胶载体的盖玻片，将其放置于一特制的塑料漏斗中，借助液体的流体力学原理，在液体中将每个盖玻片上平整铺上2块视网膜片。然后，将带有视网膜的盖玻片平移至普通培养皿中，在每个盖玻片的周围滴放适量的培养液，密封四周制成湿房，待激光切削用。

1.2.2 准分子激光PTK切削参数 能量密度：233mJ/cm2，切削直径：7mm，切削深度：50μm、80μm、100μm，氮流量：8个单位，切削频率：13Hz，激光腔气压：3200mbar，切削深度：10μm/50个脉冲，每脉冲切削深度：0.219μm，氟气：70%，切削脉冲数：250个脉冲，脉冲发生器：PTK切削仪器，机器测试参数：0.217，激光：He-Ne激光，机器型号：SCHWIND Keratom-F。

1.2.3 准分子激光PTK切削方法 通过手术显微镜在目视下，以整个视网膜为切削对象，范围覆盖整个视网膜，先调节好焦距，对好焦点后，启动切削开关，一次性完成预定切削深度。在切削前均保持被切削片表面覆盖一层液体。如此进行，三组切削深度均切削16块视网膜，共计切削视网膜块48个。

1.2.4 感光细胞片层的光镜和扫描电镜分析 将每个切削组的16个感光细胞片层均分成两组(每组8块)分别行H-E染色联合光镜检查，以及扫描电镜分析。

2 结果

按照所设计的切削参数，分别对三组视网膜块进行50μm、80μm及100μm深度切削，每组均切削16块视网膜。比较三种切削深度条件下所得感光细胞片层结构，结果发现80μm深度切削所获得的感光细胞片层最为理想。

2.1 不同深度切削制备的感光细胞片层结构特点

2.1.1 对照组视网膜组织结构特点 本研究以同期新出生的小牛视网膜为正常对照组（见图1）。从图1可见，此期神经视网膜各层结构已经形成，但外网状层(OPL)和内网状层(IPL)较厚。感光细胞节段虽已经形成但较短小，外核层(ONL)和内核层(INL)胞核层数较多。
2.1.2 50μm深度切削制备的感光细胞片层结构特点 按50μm深度切削制备成的感光细胞片层残留内核层较厚（见图2）。从图2中可见，感光细胞节段层已形成但同样较短，ONL层胞核数较多，OPL较厚和疏松。从感光细胞片层内侧面可见残存的内颗粒层，胞核层厚达4～5层，片层最内侧为激光切削面。

2.1.3 80μm深度切削制备的感光细胞片层结构特点 按80μm深度切削所得的感光细胞片层残存的内核层数则较少（见图3）。从图3可见，除与上述具有相似结构特征的感光细胞节段层、ONL、OPL之外，在片层的内侧可见残留的内颗粒层，仅含有1～2层的胞核，在片层内侧为较致密的激光切削面。

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